選擇合適的技術(shù)路線會(huì)讓整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程事半功倍，少走彎路，一般來(lái)說(shuō)要遵循幾個(gè)基本的原則：最根本的一點(diǎn)是要能滿足實(shí)驗(yàn)需求，例如研究一個(gè)人源蛋白，對(duì)其活性或者翻譯后修飾要求很高，那就首選哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，或者只需要簡(jiǎn)單 Western Blot 驗(yàn)證，那大腸表達(dá)就能滿足需求；二是經(jīng)濟(jì)性及時(shí)效性，一般來(lái)說(shuō)大腸表達(dá)最快、成本也最低，哺乳動(dòng)物表達(dá)成本較高，時(shí)間也較長(zhǎng)；三是技術(shù)熟練度及其他需要考慮的問(wèn)題。

一、設(shè)計(jì)問(wèn)題

設(shè)計(jì)問(wèn)題常出現(xiàn)在新手中，常見的幾個(gè)問(wèn)題如信號(hào)肽未去除、密碼子位移等。成熟蛋白一般是不帶信號(hào)肽的，大腸桿菌本身也缺乏處理信號(hào)肽的機(jī)制，信號(hào)肽本身一般也具有較強(qiáng)的疏水性，帶信號(hào)肽表達(dá)會(huì)導(dǎo)致蛋白無(wú)活性或大量包涵體等問(wèn)題，所以一般在原核表達(dá)時(shí)候會(huì)去除信號(hào)肽；密碼子移碼主要容易在選擇酶切位點(diǎn)時(shí)候出現(xiàn)，比如常見的 Nco I 位點(diǎn)。另外比如稀有密碼子可通密碼子優(yōu)化解決，在蛋白不表達(dá)的時(shí)候可以嘗試優(yōu)化一下密碼子；序列 GC 含量、蛋白大小等問(wèn)題都是在設(shè)計(jì)時(shí)候需要考慮到的問(wèn)題；純化標(biāo)簽的選擇，促溶標(biāo)簽對(duì)后續(xù)研究是否有干擾等也需要全面考慮。

二、表達(dá)及純化過(guò)程中遇到的問(wèn)題

1、蛋白不表達(dá)

蛋白不表達(dá)原因很多，大部分情況下可以從下面的幾個(gè)方面去調(diào)整排除。通常來(lái)說(shuō)原核表達(dá)中小于 10kd、大于 100kd 的蛋白是比較難表達(dá)的；質(zhì)粒構(gòu)建好后一定要通過(guò)測(cè)序確認(rèn)，仔細(xì)比對(duì)載體序列及插入序列，確保沒有移碼及突變；檢查表達(dá)菌株與質(zhì)粒是否配套，比如Novagen 的 pet 系列載體是 T7 啟動(dòng)子，配套常用 BL21 及其衍生菌株，Qiagen 的 pQE 系列載體使用的是 T5 啟動(dòng)子，需要用到 M15 等配套菌株做表達(dá)；檢查表達(dá)條件是否合適，比如誘導(dǎo)型表達(dá)是用誘導(dǎo)劑還是溫度誘導(dǎo)，是否是組成型表達(dá)等；培養(yǎng)基的選擇，LB 培養(yǎng)基中不表達(dá)，換用富營(yíng)養(yǎng)的 TB 培養(yǎng)基可能會(huì)解決這個(gè)問(wèn)題；也有可能是蛋白表達(dá)量太低或者是降解快，必要時(shí)需要通過(guò) Western Blot 來(lái)確認(rèn)。

2、純化中常見問(wèn)題

2.1 包涵體及其復(fù)性 

包涵體在原核中及其常見，通常來(lái)說(shuō)是因?yàn)榈鞍撞徽_折疊形成的，原因很多，可能表達(dá)過(guò)快而來(lái)不及折疊，也可能是缺少翻譯后修飾導(dǎo)致不正確折疊，還可能是蛋白本身疏水性強(qiáng)等各種原因，可以通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑濃度、引入分子伴侶共表達(dá)、換專用感受態(tài)等方式來(lái)解決，或者包涵體純化后復(fù)性，注意包涵體純化復(fù)性一般是 his 標(biāo)簽蛋白，常用變性劑為尿素和鹽酸胍，其他純化標(biāo)簽需要注意是否兼容變性劑。包涵體純化后的復(fù)性是一個(gè)世界性難題，并沒有一個(gè)通用解決方案，常用的復(fù)性手段有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、分子篩及離子柱層析等，復(fù)性遵循原則：低溫、低濃度、小梯度，添加劑如 PEG8000、精氨酸等在復(fù)性中也常用到，可在一定程度上提高復(fù)性成功率。

   包涵體
 1：誘導(dǎo)前 ，2：誘導(dǎo)后，3：包涵體，4：上清

2.2 蛋白降解 

降解也是純化中常見的現(xiàn)象，一般是因?yàn)榧?xì)菌本身的蛋白酶引起的，在破胞及后續(xù)的操作中保持低溫及全程添加蛋白酶抑制劑能一定程度上解決降解問(wèn)題；buffer 中加 5-10%甘油也能起到抑制降解的作用；檢查蛋白序列，可參考 pET 手冊(cè)中的 N 端原則，如果 M 后為精氨酸 、賴氨酸、 組氨酸 、苯丙氨酸 、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸或色氨酸等的話可能對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響較大，盡量避免；也可能是表達(dá)提前終止，或者因?yàn)槊艽a子偏好性問(wèn)題，可換用其他感受態(tài)如 Rosett、OrigamiB 等嘗試；如果真核蛋白翻譯后修飾對(duì)蛋白穩(wěn)定性有影響的話需要考慮換用真核表達(dá)。

2.3 蛋白純度不高 

純化過(guò)程中洗雜并不是每次都能很完美洗去雜蛋白，特別是Ni 柱純化的蛋白，通常雜蛋白較多，需要多種純化方式聯(lián)用，比如離子交換、疏水作用純化、分子篩等。原核表達(dá)純化蛋白時(shí)候很多時(shí)候分子伴侶會(huì)跟目的蛋白一起很難分離，可通過(guò)離子柱來(lái)結(jié)合分子伴侶蛋白而讓目的蛋白直接流過(guò)柱子來(lái)分離，也可嘗試 Ni 親和層析時(shí)候用高鹽 buffer（eg：2M NaCl），很多時(shí)候也能達(dá)到目的；也可更換表達(dá)感受態(tài)，降低表達(dá)背景，如 plysS 菌株；標(biāo)簽聯(lián)用也能有效提高純化純度，并且很大程度上可以減少工作量，例如先用 his 標(biāo)簽親和層析，再用 flag 標(biāo)簽做二次純化，因 flag 特異性很強(qiáng)，二次純化能明顯提高蛋白純度，但因其成本較高，flag 等標(biāo)簽在大規(guī)模純化中不常用。

2.4 SDS-PAGE 條帶與預(yù)測(cè)大小不符

由于蛋白表達(dá)后存在多種狀態(tài)，電荷分布可能有差異，導(dǎo)致遷移速率有變化，會(huì)導(dǎo)致 SDS-PAGE 條帶偏移，復(fù)性后蛋白與變性蛋白比較容易出現(xiàn)大小偏移現(xiàn)象，不同的翻譯后修飾也會(huì)導(dǎo)致條帶大小不一樣，比如 Tau 蛋白存在多種異構(gòu)體，同時(shí)具有較為復(fù)雜的磷酸化、泛素化、糖基化等等翻譯后修飾，所以可能會(huì)出現(xiàn)多條條帶現(xiàn)像（eg：30-80 kDa），原核表達(dá)的 tau 與磷酸化 tau蛋白大小就有明顯差異，必要時(shí)候可通過(guò) WB 驗(yàn)證。

以上只討論了體外表達(dá)中所遇到的一小部分問(wèn)題，研究過(guò)程中遇到問(wèn)題時(shí)需要大量排查、試錯(cuò)工作，特別是在面對(duì)一個(gè)全新蛋白的時(shí)候，細(xì)心才是成功的關(guān)鍵。