免疫熒光染色技術在植物細胞中的應用
一、前言
免疫熒光染色(Immunofluorescence staining)是利用抗原抗體特異性結合原理,并結合熒光標記物對組織、細胞或細胞內蛋白等大分子物質進行定位和定量分析的實驗方法。這種技術的特點在于將免疫反應的高特異性和熒光檢測技術的高靈敏度相結合,從而實現對目標分子在亞細胞水平上的可視化觀察。應用方面,免疫熒光染色技術廣泛應用于:基礎生物學研究:在細胞生物學中,主要用于研究細胞內蛋白質分布、相互作用、信號轉導通路等;
腫瘤標志物檢測:免疫熒光技術可用于檢測腫瘤細胞中的標志物,從而輔助癌癥的診斷和研究;
病原體診斷:免疫熒光技術可以用于檢測細菌、病毒等病原體在組織或細胞樣本中的存在和分布;
治療效果評估:近年來,隨著新型治療方法的發(fā)展,免疫熒光染色被用來評估這些療法對特定靶標的影響,例如測定促炎細胞因子的變化情況。
總之,免疫熒光染色技術因其操作相對簡便、結果直觀且靈敏度高的特點,在科研和臨床領域都有著極其廣泛的應用。本文介紹一種既簡潔又高效的植物細胞免疫熒光染色方法,以供同行專家及學者參考和應用。
實驗操作流程見圖1(以擬南芥為例,研究葉綠體中蛋白定位)。
圖1.流程示意圖
二、操作步驟
1、切割葉片
將新鮮采摘的葉片用手術刀片或者鋸齒狀刀片切成細絲狀,然后立馬放入固定液中,可收集到1.5ml ep管中避光固定1-2h。可選固定液配方:0.4 M Mannitol, 20 mM KCl, 20 mM MES (pH 5.7), 4% paraformaldehyde,不同物種或組織滲透壓可能有差異,注意選擇合適的Mannitol濃度。固定后顯微鏡觀察細胞狀態(tài),如圖2所示,注意組織盡量切得細而碎;
圖2.葉片固定效果
2、抗體孵育
將固定后的細胞收集在EP管或小試管中,1 x PBS清洗三次,每次5min。在清洗后的樣品中加入適量封閉液室溫封閉30min,可選封閉液:含5% BSA和0.15% Triton X-10的 1 x PBS 。加入特定一抗,孵育2h,一抗可直接用封閉液稀釋。用含5% BSA的1 x PBS清洗3次,每次5min。加適量帶FITC標簽二抗避光孵育1h,二抗可用含5% BSA的1 x PBS稀釋使用,二抗孵育結束后用1 x PBS清洗3次;
3、樣品中加適量0.5M EDTA.Na2 (pH 9.0),55℃水浴1h,結束后去除EDTA,加入封片劑(5 mM 抗壞血酸鈉、15 mM Na2HPO4 pH 9.0、50% 甘油),可短時間4℃保存;
4、熒光顯微鏡觀察,觀察時可用鑷子輕壓、敲擊蓋玻片,使細胞分散均勻,便于觀察,結果如圖3所示。
可選步驟:細胞壁的存在讓抗體進入細胞困難,可在細胞固定后制備原生質體,得到原生質體后再進行后續(xù)操作,制備原生質體可參考以下操作;
用含0.5%(W/V)果膠酶和1%(W/V)纖維素酶的1 x TBSTx在37℃酶解1h,倒掉酶解液,用1XTBSTx洗3次,每次10min,注意洗的時候在搖床上慢搖(10xtbst的配置:24.2gTriis,80gNaCL;用HCL調節(jié)pH為7.6,定容至1L,加Triton-100使終濃度為1%。)
圖3.結果示例
免疫熒光實驗是一種常用的生物學研究手段,它利用不同的標記來實現多種研究目的。在實驗操作中,需要細心謹慎,同時好的抗體也是實驗成功的重要保證。一抗大部分情況下為特別制備抗體,需要在實驗中多次摸索稀釋比例,二抗一般選擇商用FITC二抗,需根據一抗來源選擇合適的產品。熟悉原理,操作細心,一定能得到漂亮的免疫熒光染色照片。
參考文獻:
Wang, L., et al. (2022). "A Tissue-Chopping Based Immunofluorescence Staining Method for Chloroplast Proteins." Front Plant Sci 13: 910569.